苯并芘（BaP）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒

使用说明书

本试剂盒仅供研究使用。

1 使用目的：

本试剂盒用于奶油，鸡蛋、蜂蜜、牛奶、血清和尿样，植物油中苯并芘（BaP）残留的定量检测。

2 实验原理

本试剂盒采用竞争ELISA方法，在微孔板包被有苯并芘（BaP）偶联抗原，加入苯并芘（BaP）标准品或样品，游离苯并芘（BaP）与微孔条上预包被的苯并芘（BaP）偶联抗原互相竞争抗苯并芘（BaP）抗体酶标记物，用TMB底物显色，加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，用酶标仪在450nm波长下进行检测，吸光值与样品中苯并芘（BaP）含量成反比，通过标准曲线计算样品中苯并芘（BaP）的含量。  

3 试剂盒组成

1. 预包被的苯并芘（BaP）偶联抗原的可拆酶标板：1块（12孔×8条）。
2.苯并芘（BaP）标准品：6瓶（1ml/瓶），含量分别是： 0 ppb，0.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7 ppb,8.1 ppb。
3.抗苯并芘（BaP）抗体酶结合物：1瓶（6ml）。
4.显色液A：1瓶（6ml）。
5.显色液B：1瓶（6ml）。
6.终止液：1瓶（6ml），2M硫酸。
7.样本稀释液：1瓶（10×,  6ml），用于样品稀释用。
8.浓缩洗涤液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。
9.说明书一份。

4 需要而未提供的材料
1.设备
2.波长450nm酶标仪。
3.粉碎机。
4.量筒。
5.振荡器。
6.漏斗。
7.Whatman No 1或相当的滤纸。
8.微量移液器。
9.试剂
10.去离子水或蒸馏水。
11.甲醇。
5 贮存
试剂盒贮存于2~8℃，切勿冷冻 未用完的微孔板应该密封干燥保存
6 注意事项
1.使用试剂盒前请仔细阅读说明书。

2.不要使用过期试剂盒。
3.试剂盒使用前，将试剂恢复至室温（25±2℃），建议至少回温2小时。
4.标准品中含有苯并芘（BaP），使用时应特别注意，操作时应带手套。
5.终止液中含有硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。
6.不同标准品、样品所用吸头不能混用，否则会影响试验结果。
7.不同批号试剂盒中的试剂不得混用；不同标准品、样品所用吸头不得混用，否则会影响实验结果。
8.稀释样本时必须用本试剂盒中的样本稀释液，否则会影响实验结果
9.混合试剂时应避免起泡。
7 工作液准备
1.苯并芘（BaP）标准品溶液：0ppb,0.1ppb,0.3 ppb,0.9ppb,2.7 ppb,8.1ppb
2.浓缩洗涤液：用蒸馏水按1:20(1+19)稀释备用

3.样本稀释液：用蒸馏水按1:10(1+9)稀释备用
4.显色剂：已备用，避免光线直照
5.反应终止液：已备用
8 样品处理程序（样品在提取过程中，要严格按说明书操作，提取过程中应准确稀释，否则会出现结果不准确，样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存）
1.取10g粉碎的样品，加 20ml 70%甲醇溶液
2.强力振荡3分钟
3.用Whatman No 1滤纸过滤
4.取25µl处理后的样品，加入25µl样本稀释液于反应孔中（样本稀释倍数为2）
9 酶免分析步骤
1. 实验须知
2.实验开始前请将所有试剂于盒外充分恢复至室温（25±2℃），时间约2小时。回温至室温（25±2℃）后再取出微孔条，多余的微孔条重新密封立即于2~8℃干燥保存
注：一定保证回温充分，否则影响检测的精确度和准确度。
3.使用后请立即将试剂放回2~8℃保存
4.请不要改变分析程序
5.请使用精确的微量移液器
6.操作一旦开始，请不要中断任何程序
7.ELISA结果的可重复性极大程度的取决于操作程序，请严格按照要求操作
8.为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的吸头加样
9.加样时请勿让吸头接触微孔中的溶液或内表面
分析步骤
1.预先进行编号，标记B0、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测
2.取所需数量的微孔（微孔条可拆），将多余板条重新密封并立即放回2~8℃保存
3.样品稀释液（10×）、浓缩洗涤液（20×）稀释成工作液(蒸馏水或去离子水稀释)
4.在B0孔中加入50µl  0.0 ppb标准品溶液
5.在各标准孔中加入50μl的标准品溶液
6.在各样品孔中加入50µl样品溶液
7.在所有孔中加入50µl的抗苯并芘（BaP）抗体酶结合物
8.轻轻晃动反应板几秒钟。
9.37℃温浴30min （温浴过程中不时轻拍反应板，可以减少双孔误差）
10.甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板5次，最后一次应在吸水纸上拍打以完-全除去孔中液体。

11.反应
12.洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50µl显色液A，再加 50µl显色液B；轻微晃动反应板使之彻-底混匀
13.37℃温浴10min
14.每孔中加入50µl终止液，混匀
15.在450nm下检测吸光度，结果在5min内读取。
10 结果计算
1.定量分析
2.所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ppb标准溶液的平均吸光度值
3.以苯并芘（BaP）浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。根据样品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为苯并芘（BaP）浓度的对数值，求得反对数即为测定液中苯并芘（BaP）浓度C（ppb）
4.由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释倍数。
5.半定量测定
6.目测半定量测定： 首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品颜色深浅比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。
7.仪器半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品吸光度值的高低比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。

11 特异性
物质 交叉反应 苯并芘（BaP） 100%
12 试剂盒参数
本试剂盒检测下限为0.05ppb
B0吸光度最佳值应大于1.0
试剂盒吸光度板内误差小于8％，板间误差小于15％。
用本说明书提供的组织样本提取方法回收率大于80％。
试剂盒提供的标准曲线范围为0.1ppb~8.1ppb。
14 分析限制
本试剂盒检测为阳性的样品应该用另一种方法如HPLC或GC/MS加以确证。