ELISA法检测HBsAg假阳性和假阴性的影响因素

 ELISA法HBsAg假阳性和假阴性

  为了减少HBsAg检测出现假阳性和假阴性，我们有必要对这种现象的原因进行分析，在实际的检测工作中，造成HBsAg检测出现假阳性和假阴性主要受以下因素影响，分述如下：

一、ELISA法假阴性原因

1. 标本用肝素或EDTA等抗凝处理易造成HBsAg检测结果假阴性，肝素抗凝血浆会增加OD值,可能与高浓度肝素具有强大的负电荷,能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中的辣根过氧化物酶活性，造成假阴性。


2. 标本保存不当,在冰箱内保存过久的标本,血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体。标本放置时间延长（如一天以上），有时抗原或抗体免疫活性减弱，便出现假阴性。因此若采血后不能及时检测，5天内检测标本分离血清置于4。C冰箱内；超过5天不能检测的，应放在-20。C低温冰箱中。


3. 低浓度HBsAg标本（弱阳性HBsAg）易受加样时间（特别是大批量标本）、试剂平衡时间、溶血程度的影响，出现假阴性。如加样时间在30分钟内的差异是zui大的。


4. 高浓度HBsAg在ELISA一步法检测中易出现假阴性，即HBsAg的钩状效应。从原理来讲，一步法中HBsAg与包被板上的HBsAb及酶结合的HBsAb结合是双向的，当HBsAg浓度过高时，HBsAg与包被板上的抗体及酶结合物中的抗体均是单向结合，不能形成抗体－抗原－抗体酶复合物，使酶标记抗体在随后的洗板中洗掉，从而显出阴性结果。但是在ELISA两步法中，高浓度的HBsAg只能与包被的HBsAb“饱和"地结合，多余部分被洗掉，随后加入的酶结合的HBsAb正好通过HBsAg的“桥梁"作用而结合在酶标板上，显示阳性结果。因此当HBsAg强浓度时用ELISA一步法检测存在假阴性现象。解决此问题的zui hao办法有：对标本进行稀释；不单检测HBsAg；采用ELISA两步法检测可消除漏检现象。


5. 由于慢性病毒携带者(低水平HBsAg携带者)或HBV感染的潜伏期,HBsAg浓度低于检测水平的下限，由此造成假阴性。


6. S基因突变导致HBsAg的氨基酸结构改变，由于多数商用试剂盒检测系统采用的为多克隆抗体检测HBsAg的a决定簇，这一区域的点突变即可导致临界观测值或阴性结果，造成假阴性。


二、ELISA法假阳性原因

1. 溶血或红细胞：有国内报道酶免HBsAg试剂检测溶血标本时可造成假阳性，因红细胞破坏溶解时释放出大量血红蛋白，血红蛋白的亚铁血红素具有弱过氧化物酶活性，其作用效应与辣根过氧化物酶（HRP）类似，能与预包被抗体（Ab）结合，一步法洗脱步骤往往难以wan全洗脱，残留的过氧化物酶催化底物四甲基联苯胺（TMB）产生假阳性。因此在采集血标本时，量不能太少，操作过程中如果血清混浊，一定要离心后再吸样，避免红细胞加入造成假阳性。对于溶血的标本zui重新采集血液，进行重新检测。


2.  标本凝集不全或标本离心处理时采用不同的离心转速和离心时间,也可造成假阳性结果。若在血液还未开始凝固时即强行分离血清，此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；离心转速过低或离心时间过短，由于血液离心不充分均可导致假阳性。解决的办法zui是血液标本采集后放水浴箱，使其充分凝固再用3000rpm,离心15分钟再分离血清。


3. 干扰物质的影响：如类风湿因子（RF）、补体、AFP等可以造成HBsAg检测结果假阳性。RF因子可与标记二抗的Fc段结合造成假阳性；补体从C1q活化，使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构，Fc的C1q分子结合点暴露出来，则补体C1q可将二者连接起来造成假阳性，采用56。C30分钟灭活补体可降低假阳性率；高浓度的AFP（如孕妇），在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深造成假阳性结果。


4. 某些细菌污染标本(如表皮球菌等),菌体中可能含有内源性HRP，造成检测结果假阳性。