ELISA的实验流程及技术要求

ELISA检测试剂盒实验流程:
1.实验前标准品、试剂及样本的准备;
2.加样(标准品及样本)100uL,37°C孵育1小时;
3.吸弃,加检测溶液A100uL,37°C孵育1小时;
4.洗板3次;
5.加检测溶液B100uL,37°C孵育30分钟;
6.洗板5次;
7.加TMB底物90uL,37C孵育10-20分钟;

8.加终止液50uL,立即450nm读数。

ELISA检测试剂盒注意事项:

1试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
2,浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温
助溶,洗涤时不影响结果。
3.各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
4.如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品fl*孔的OD值),请先将样本稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请后乘以稀释倍数(x5xn)。
5封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6.本试剂不同批号组分不得混用。显色剂B请避光保存。
7,严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶
标仪读数为准.
8.所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9.如以说明书有异,以说明书为准
ELISA检测试剂盒操作技术要求:
1、加样量的准确与否,直接影响抗原抗体结合物的浓度,直至最后显色的深浅。吸嘴插入血清不可太深,若插入太深,吸嘴外壁可能粘连太多血清,轻微的抖动动即可将吸咀外壁的血清溅入其它包被孔中,造成交叉污染。加样时应尽可能的垂直加样,并加在包被孔的底部,不可加在孔的上部。标本量大时,可考虑使用排枪加试剂,可提高速度,但使用排枪时应注意吸嘴一定要装好,不可松动,否则会影响加样量的准确度。加样时保持显色剂不外流,显色剂应避免接触金属器械。加终止液时应避免产生气泡。
2、加样时间间隔对结果也有一定的影响,在竞争法试验中,理论上应该是标本与酶标抗体混合后同时加入反应孔,若标本先于酶标抗体加入反应孔,则标本会先与包被抗体进行反应,造成特假阳性。若是有干扰物质存在时表现明显,在公平条件下,干扰物质与包被抗体的结合能力会低于标本,而在非公平条件下,干扰物质会优先与包被抗体进行结合,出现假阳性。做HBcAb项目时,若标本与酶加样时间间隔太长,会引起吸光度的趋势性变化,会造成吸光度的降低。特别是针对临界值标本,出现假阳性。